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傅立叶变换红外光谱在癌症检测中应用的研究pdf

归档日期:06-18       文本归类:发散束卷积法      文章编辑:爱尚语录

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  中国科学技术大学硕士学位论文 摘要 癌症是目前死亡率极高的疾病。癌症的早期诊断对于癌症的治疗和降低癌 症死亡率至关重要。傅立叶变换红外光谱(FTR)作为一种快速无创伤的物质 分子结构的有效分析手段逐渐被应用到癌症检测中。本文对傅立叶变换红外光谱 在癌症检测中的应用进行了初步的探究并应用了新的红外光源一一同步辐射。本 文通过肺癌、消化道癌、鼻咽癌等癌症患者指甲粉末与正常人指甲粉末,宫颈癌 细胞和Hela细胞与正常宫颈脱落细胞以及胃癌组织与正常胃组织的FTIR的比较 研究表明:癌症患者的样品,无论是分子层面,还是细胞和组织层面都与正常人 的有很大差别,这些差别主要体现在核酸、蛋白质、脂质和糖类上,尤其在核酸 上的差别最为明显。因此,FTIR可以从分子角度揭示肿瘤的特征,为癌症检测 提供了新的线索。此外,本文重点讨论了指甲粉末的FTIR研究。指甲为人体外 部器官,是从表皮细胞演变出来的,主要成分为角蛋白。根据中医理论,它能在 一定程度上反映人体脏腑、器官、组织各部分的病理生理变化,而且指甲取样非 常方便并且不会给病人带来痛苦,因此,FTIR检测患者指甲可以作为癌症检测 中一项新的指标,不仅快速无创伤,而且操作简便,费用低,有望成为癌症早期 检测的有效手段。 另外,利用合肥光源软X射线显微术站所提供的“水窗”波段的准单色软 x射线对硅藻进行了成像实验研究,并对其结果进行了分析。同时,对影响图像 分辨率的主要因素进行了简要讨论。 关键词:傅立叶变换红外光谱癌症指甲 同步辐射软X射线显微术 中国科学技术大学硕士学位论文 Abstract deathin of CancercallcaBse ratethe diagnosis veryhigh present.Thus,theearly for death Transform cancerisvitalCallCer and rate.Fourier therapydecreasing Infrared(FTIR)techniquehasbeenusedindiagnosisofcancergraduallyduetoits likefast nodegtuctionto thesis the detectionand advantages samples.Theexplored anduseda infrared ofFTIRinthe ofcancer new application diagnosis primarily light source--SynchrotronRadiation.TheeompurisonstudyofFTIRbetweenthe andthosewithcancer and fingernailspowderofnormalpeopleofhing,digestivetract normalcervicalcellsandCervicalcarcinomacellsandHela nasopharynx,the cells, thenormalstomachtisSuesandthosewithcareinomashowedthatthe from samples withcancerwere differentfromthoseofnormalinFTIR.n0 patients very people matterthe weleonthemolecularleveloroncellortissuelevel.The sanaples differencesare ORnucleic and onnucleic mainly sugar,especially acid,protein,lipid acidwhichis die ofcancerfrom characteristic.Therefore,FTLKCanrevealcharacter the ofmoleculesand anewclueforthe ofcaneer. point provide diagnosis Onthe Furthermore,thethesisfocused viaFTIR.Fingernails researchoffingernails are the andtheirmain theouter ofhumanevolvedfrom cells organs body epidermis componentsarekeratin.Accordingtothetheory callreflectthe and ofitmer change boay.And,it fingernails pathologicalphysiological is to andwillnotcause tothe very getfingernails anypain patientS,SOdetecting easy FTIRCallbeanew for willbea guideline ofcenter,which fmgemailsby diagnosis effectivemethodfor ofcancerbecauseitisnot fastand110 prospective diagnosis only workandlowcost∞well. destruetinn,but easy In researchOUNitzschiahantzschia the addition,the using experimental imaging soft on“water Soft x-ray window’providedby X-rayMicroscopy缸HcfciLight carriedout.Thewas and result Source(HLS)WaS reportedanalyzed.Moreover,the factors were main resolutiondiscussed impact ofimage briefly. words:FourlerTransformCancer Key Infrared(FTIK)Fingernails RadiationSon Synchrotron X-rayMicroscopy 中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究 工作所取得的成果。除己特别加以标注和致谢的地方外,论文中 不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权, 即:学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版,允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文编入有关 数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 , 作者签名: ≯噼,月,d日 中国科学技术大学硕士学位论文 第一部分傅立叶变换红外光谱在 癌症检测中的应用研究 第一章绪论 癌症是当今世界危害极大的疾病,其死亡率尽次子心血管疾病,居于第二位。 全世界每年有约600万人死于癌症,我国每年被确诊的癌症患者就约达160万到180 万人之多,其中大约130万人死亡。癌症的治疗是世界各国科学家长久重点攻克的 难题,目前尚没有找到治愈和缓解的有力治疗手段。虽然迄今尚未找到治愈癌症 的最佳方案,但是随着研究的进一步深入和各种技术的发展,对癌症的本质认识 越来越清晰,各种治疗技术和先进设备为治疗癌症提供了美好的前景。然而,如 果这些癌症能被早期诊断,几乎都可以被治疗,这样就会大大降低死亡率。目前 应用较广泛的诊断方法有影像学诊断、内腔镜诊断、生化诊断和病理诊断等诊断方 法,但是每一种都有其局限性,如操作麻烦,费用高,给病人带来痛苦等,因此 如果能找到一种简便,低廉并容易普及的早期诊断方法对于癌症的临床应用具有 重大意义。随着量子生物学的发展和光谱技术在生物学中应用发展,利用光谱技 术来诊断治疗癌症的研究开展起来。在所有这些研究中,傅立叶变换红外光谱在 癌症检测中的应用研究最为广泛,也最具有应用前景。本章首先介绍了癌症和癌 症检测以及傅立叶变换红外光谱的一些基本知识,并且介绍了作为傅立叶变换红 外光谱新光源一一同步辐射红外光源的一些优势,然后对目前国内外关于傅立叶 变换红外光谱应用于癌症检测研究进行归纳,最后阐明本论文的选题依据和研究 内容。 §1.1癌症简介 I.1.1癌症基本概念 癌症是由携带遗传信息的DNA的病理变化而引起的疾病l“。人体肿瘤是在各种 中国科学技术大学硕士学位论文 内在和外在致癌因素导致的。在内园或外因的影响下,一个细胞的增殖活动失常, 突破了J下常的限制机制而异常快速增殖,形成了组织肿块,这种由异常增殖而形 成的细胞群称为肿瘤。致癌因素作用于正常细胞的遗传物质,使其出现异常,这 种异常会随着细胞的分裂和繁殖传到下一代,所以一旦细胞发生癌变后r即使致 癌因素被消除了.这种癌变也不会恢复,而是一代代的无限制的繁殖下去,形成 肿瘤而与机体失去协调。根据肿瘤的形态学和生物学行为可以将其分为良性肿瘤 和恶性肿瘤,仅快速增殖而不播散的称为良性肿瘤;而不仅异常快速增殖,而且 细胞可发生扩散性转移的,称为恶性肿瘤,特称为癌或新生物。在癌症中,根据 其发生来源,又可将癌症分为几类:①癌,发生于上皮组织,如皮肤癌,肠,肺 等上皮细胞癌,均为外胚层和内胚层来源:②肉瘤,由结缔组织和肌肉产生的癌, 为中胚层组织来源;③淋巴(肉)瘤,淋巴细胞癌变产生,亦为中胚层来源。此 外,尚有由早期胚胎细胞转化产生的畸胎瘤,畸胎瘤有良性的,亦有恶性的。癌 的主要特征有两点:①不受机体整体的制约:②除了侵占正常细胞所占的空问外, 还发生扩散和转移,形成新的病灶,原发部位称之为原发癌,转移部位称为继发 癌。 1.J.2癌细胞的基本特征 ①形态上发生改变 细胞外形发生改变,如微绒毛、片足和丝足缩回,表面圆泡增加,外形变 圆等;细胞骨架紊乱,核异常以及质膜结构发生变化等。 ②细胞生长与分裂失去控制 癌细胞失去控制,成为“不死”的永生细胞,核质比增大,分裂速度加快, 失去最高分裂次数而无限繁殖。如1951年从黑人妇女HenriettaLacks身上取出 的宫颈癌细胞,建成了Hela细胞系,至今宋发现衰老。 ③具有侵润性和扩散性 这是恶性肿瘤(癌)和良性肿瘤的主要区别。癌细胞的细胞间粘着性下降, 易于侵润周围的健康组织或通过淋巴途径或血液循环转移到其他部位发生增生。 经转移并再身体其他部位增殖产生的次缴肿瘤称为转移灶。癌细胞在分化程度上 要低于良性肿瘤细胞,并且失去了许多原组织细胞的结构和功能。 中国科学技术大学硕士学位论文 ④细胞问相互作用改变 癌细胞冲破了细胞识别作用的束缚,在扩散过程中,不但表达~些水解酶 类,还表达了一些膜受体蛋白,以便粘附别处细胞。 ⑤蛋白表达谱系或蛋白活性改变 癌细胞异常表达一些与恶性增殖和扩散等过程相关的蛋白成分,如纤连蛋 白减少,某些癌蛋白过度表达,分泌多种蛋白水解酶等。在癌细胞的蛋白表达谱 系中,往往还会表达一些在胚胎细胞中表达的蛋白。另外,多数癌细胞中的端粒 酶活性较高。 ⑥mRNA转录谱系的改变 基因表达及其调控方向的改变是造成细胞癌化的根源。利用基因表达谱分 析技术(SAGE)对乳腺癌和直肠癌与正常细胞中基因表达谱进行了比较,发现在 检测的30万个转录片段中,至少相当于4.5万个所表达的基因中约有500个转录片 段(相当于75个基因),占整个基因表达谱中的很小一部分【2】。 I.I.3致癌因素 癌是由正常细胞突变而来,能导致细胞癌变的物质称为致癌剂‘”,其种类繁 多,根据其本身的性质可以分为三类: ①化学致癌剂 目前已知的化学致癌剂有数千种,既有有机物也有无机物。有机物如尼古 丁,亚硝胺,苯,黄曲霉素等等。无机物如镍化合物,铬化合物,砷,石棉 等等。化学致癌剂的致癌作用有一定的时间性和剂量效应。有些致癌剂具有 直接致癌作用,而有些在进入人体后需经激活才能与DNA作用并使其发生突 变。 ②物理致癌剂 主要的物理致癌剂为辐射致癌。辐射使染色体发生突变,易位或者断裂, 激活癌基因或着抑制抑癌基因的活性。 ③病毒致癌剂 引起细胞癌变的病毒称为肿瘪病毒,又称为致癌病毒。肿瘤病毒中既有DNA病 毒,也有RNA病毒。现已知上百种作用于从青蛙到灵长目动物的致癌病毒,三分之 中国科学技术大学硕士学位论文 ~是DNA病毒,三分之∑是RNA病毒。 §1.2 当前各种癌症检测方法及其局限性 对于癌症的检测和治疗一直是医学上的重要课题。目前有一下几种检测方法 但每种方法都有其局限性f3J= 1.2.1影像学诊断 主要包括普通X线诊断,磁共振成像棚RI)诊断,电子计算机x线体层扫描技 术(cT),放射性药物显像诊断以及超声诊断等。普通x线诊断是利用人体不同组 织对x线的吸收程度不同进行诊断的图像方法【4I。这是一种常用而且方便的诊断 手段,但其对组织密度的分辨率不高,很难观察到实质性器官内的肿瘤,且X线 伤害人体,副作用较大。磁共振成像术(MRI)p】是运用计算机对人体内氢原子在磁 共振过程中发出的电磁波信号进行图像重建的一种检查方法。MRI对软组织的成像 对比分辨率高,可直接反映病变范围和侵犯周围组织结构情况。但MRI易受呼吸 运动和肠蠕动的影响而产生伪影,影响诊断。而且对良恶性肿瘤的鉴别存在一定 困难,其费用也较高。c”】则是利用高度准确的x射线绕身体对某~部位进行断 面扫描,然后经计算机出来处理将该层面上X线能量衰减信号以不同灰度等级的 图像显示出来.口弥补了普通X线诊断的许多缺陷,是目前诊断体内各部位肿瘤的 一个重要的手段,并能引导进行对肿瘤的经皮穿刺活检,局部化疗液体引流等。 但cT检查会受脏器生理运动影响而可能形成伪影,空腔脏器或内有气体的器官容 易形成伪影。此外,对于与刷围正常组织密度相近的肿瘤,由于密度差不明显, cT诊断也存在一定的困难。放射性药物显像诊断(7]是指向人体内注入放射性药物, 放射性药物会选择性浓集于某一器官或肿瘤病变区,然后用显像设备在体外显示 放射性分布情况的诊断方法。该方法的适用范围有很大的局限性,而且需放射性 药物,对人体有害。超声诊断18】是利用病变和正常组织对声波有不同的超声阻抗 现象的一种诊断方法。超声诊断有很多有点,如对人体无痛苦,可反复检查,操 作简便,费用低等,但是它目自口还只是一种辅助手段,还不能独立地作为准确诊 断和定位肿瘤的方法。 4 中国科学技术大学硕士学位论文 1.2.2内腔镜诊断 内腔镜为现在广泛应用于f临床上的一种新型诊疗设备。内腔镜不仅可以在直 视下确定腔道脏器肿瘤的位置和范围,进行形态学,染色、摄影、病理活检和细 胞学切片,而且还能进行器官组织功能检测。内腔镜的确具有很大的优越性,但 任何一种内腔镜在使用时都有其一定的适用范围和局限性,并可能引发一些并发 症。 1.2.3生化诊断 生化诊断是利用肿瘤病人的体液、排泄物及组织中出现某些特异物质以及其 在质或量上的改变进行肿瘤的诊断和治疗,即肿瘤标志物检测诊断。该方法对原 发肿瘤的发现、良恶性的鉴别,恶性程度分类及治疗和预后观察有重要意义[9-It]。 但对标志物有高的要求,目前还没有一种标志物能达到令人相当满意的程度,对 于某一具体的肿瘤患者,常需要同时应用几种标志物进行联合诊断才能达到较满 意的结果。 1.2.4病理诊断 尽管前述几种诊断技术发展迅速给临床上肿瘤的诊断提供了强有力的工具, 但要精确确定肿块是真正的肿瘤还是肿瘤样病损,是良还是恶,术后效果如何以 及是否有转移,复发等,最终都要依赖于病理诊断技术。常用的病理诊断技术为 冰冻切片和石蜡切片以及肿瘤细胞学检查。经过苏木素一伊红染色(HE染色)的组 织样品切片在光学显微镜即可清晰地看到其组织结构和细胞形态。这种方法准确 度很高。肿瘤细胞学诊断是通过针吸、脱落细胞,胸水、腹水、体腔液体,器官 组织分泌物,肿瘤组织表面细胞刮片或印片,用这些材料制成病理检查切片,进 行肿瘤细胞学检查。这种方法具有简便、安全、准确、迅速、经济等特点。但无 论哪一种病理诊断技术,都是组织或细胞的形态上进行诊断,而不是从组织或细 胞分子的角度去说明它们的差异。此外,病理诊断技术受到人为因素的影响较大。 出此可知,当前迫切需要一种简便,低廉并容易普及的早期癌症诊断方法。 中国科学技术大学硕士学位论文 §1.3 傅立叶变换红外光谱 1,3.1傅立叶变红红外光谱基本原理 傅立叶变换红外光谱(FT—IR)仪不同于传统的色故型红外光谱仪,它不是基于 光学分光,而是基于干涉调频分光的原理p】。傅里叶光谱仪可以理解为以某种数 学方式对光谱信息进行编码的摄谱仪,它能同时测量、记录所有谱图的信号,并 以更高的效率采集来自光源的辐射能量,从而使它具有比传统光谱仪高得多的信 噪比和分辨率;此外,它的数字化的光谱数据,也便于计算机处理和演绎。如图1, 红外光经干涉仅(如迈克尔逊一一干涉仪)变成干涉光,干涉光照射到样品上后可 由检测器获得时间域的强度谱一一干涉图,该干涉图经计算机进行傅立叶变换等 数学处理后即可得到频率域的强度谱一一常规红外光谱图。FT-IR的优点主要体现 在以下几个方面:(1)每一个扫描瞬间都包括了分子振动的全部信息,大大地缩 短了检测时间;(2)利用计算机进行数据处理,大大地提高了信噪比,而且要求 中最有力的光谱工具,并且可以和荧光及拉曼敞射等技术相结合,其应用极其广 泛。 ∞⑦ 一n¨U 心G一 船摊 样赫 静先鬻 捡科鼍 光诺髓 鳓⑦ 一 口 煳千己口_+G一 样品 检勰矗 干涉舶 砖荐帆 图1色散型光谱仪(A)和傅立叶变换光谱仪(B)的原理示意图 1.3.2分子的振动方式与谱带 中国科学技术大学硕士学位论文 一般把分子的振动方式分为两大类:化学键的伸缩振动和弯曲振动,也有其 他一些吸收带和振动方式如振动偶合和泛频带等。 ①伸缩振动:指成键原子沿着价键的方向来回地相对运动。在振动过程中, 键角并不发生改变。两个相同的原子和一个中心原子相连时,如一CH2一,其伸缩振 动又可分为对称伸缩振动(VS),(Symmetricstretchingvibration)和反对称伸 vibration)。 缩振动(VaS),(Asymmetricstretching ②弯曲振动:弯曲振动又分为面内弯曲振动和面外弯曲振动,分别用6、1, 表示。弯曲振动完全位于平面上称为面内弯曲振动,弯曲振动的方向垂直于分子 平面称为面外弯曲振动。剪式振动和平面摇摆振动为面内弯曲振动,非平面摇摆 振动和卷曲振动为面外弯曲振动。 同一种键型,其反对称伸缩振动的频率大于对称伸缩振动的频率,远远大于 弯曲振动的频率,且Pvasvs6,而面内弯曲振动的频率又大于面外弯曲 振动的频率。还可出现以下的吸收带和振动方式: ③倍频带。 ④合频带:倍频带与合频带统称为泛频带。 ⑤振动偶合。 ⑥费米共振:当强度很弱的倍频带或组频带位于某一强基频吸收带附近时, 弱的倍频带或组频带和基频带之间发生偶合,产生费米共振。 1.3.3影响振动吸收频率的因素 影响振动吸收频率的因素[12-141有两大类:一是内因,由分子结构不同所决定; 二是外因,由测试条件不同所造成。 I内部因素:指分子结构因素。 (一)电效应:电子效应是通过成键电子起作用。诱导效应和共轭效应都会引起 分子中成键电子云分布发生变化。在同一分子中,诱导效应和共轭效应往往同时 存在,其对吸收频率的影响由效应较强者决定。该影响主要表现在C=O伸缩振动 中。 ①诱导效应(Inductioneffect,I):诱导效应沿分子中化学键(6键、兀键) 中国科学技术大学硕士学位论文 而传递,与分子的几何状态无关。和电负性取代基相连的极性共价键,女n-co—x, 随着x基电负性增大,诱导效应增强,c=0的仲缩振动向高波数方向移动。 effect,c):共轭效应常引起C=O双键的极性增 ②共轭效应(Conjugation 强,双键性降低,伸缩振动频率向低波数位移。 ③场效应(Fieldeffect,F):在分子的立体构型中,场效应只有当空『白J结 构决定了某些基团靠得很近时力会产生。场效应不是通过化学键,而是原子或原 子团的静电场通过空间相互作用。场效应也会引起相应的振动谱带发生位移。 ④空间效应:环张力和空间位阻统称空蒯效应或立体效应。环张力引起sp4 杂化的碳一碳d键角及sp2杂化的键角改变,而导致相应的振动谱带位移。环张力对 环外取键(c:c,C=o)的伸缩振动影响较大。空间位阻的影响是指分子中存在某种 或某些基团因空间位阻影响到分子中正常的共轭效应或杂化状态时,导致振动谱 带位移。 o氢键效应:羟基与羰基之间易形成分于内氢键而使v。,‰向低波数位 移。 ∞振动偶合效应(Vibrationalcoupling):当两个或两个以上相同的基团连 接在分子中同一个原子上时,其振动吸收带常发生裂分,形成双蜂,这种现象称 振动偶合。有伸缩振动偶合、弯曲振动偶合、伸缩与弯曲振动偶合三类。如IR谱 z弯曲振动偶合引起的。 中在1380cm’和1370cⅢ-1附近的双峰是C(cH0 resonance):当强度很弱的倍频带或组频带位于某 ㈣费米共振效应(Fermi 一强基频吸收带附近时,弱的倍频带或组频带和基频带之间发生偶合,产生费米 共振。 ∞样品物理状态:样品在固、液、气三种不同状态时。其分子间距不同,分 子闻相互作用不同,因此导致得振动频率也会有所不同。 II外部因素 同一种化合物,在不同条件下测试,因其物理或某些化学状态不同,吸收频 率和强度会有不同程度的改变。 ㈠溶剂的影响:如水,水在中红外区的吸收很大,因此在检测的时候必须要考虑 水的影响,能用干燥样品尽量用干燥样品。 ㈢仪器的影响: 仪器本身的性能和分辨率对吸收的影响也很大。 中国科学技术大学硕士学位论文 1.3.4傅立叶变换红外光谱在癌症检测中的应用 自1801年William发现红外辐射现象以来,红外光谱技术已经成为各种混合 红外光谱在分析生物物质上具有重要的应用价值[1引。20世纪40年代色散型的红 外光谱仪一出现,生物学家就用它研究生物分子的红外谱图与其生化结构之间的 关系。到了50一60年代,开始了蛋白质、糖、脂等生物大分子的红外光谱分析【16‘171, 并开始研究细菌的红外光谱特征【1黔19l。但红外光谱被广泛应用于生物体系特别是 肿瘤细胞或组织的分析是在最近十几年。因为生物体系复杂,分子种类多,含有 大量的化学基团。这些化学基团的吸收带相互重叠成为复杂的吸收带,另外水的 强吸收带还掩盖了生物分子吸收带,使得生物体系的红外光谱复杂,难以解析和 应用,所以直至1984年,红外光谱才被用于正常人、白血病患者血细胞中的淋巴 细胞研究[2们。到了70年代,随着计算机技术、数据处理技术和Fourier变换仪器 的飞速发展克服了这些难题。经过计算机数据处理,水的吸收峰很容易从样品谱 中扣除,重叠的峰可分开【2¨。傅立叶变换红外光谱仪的发展极大地提高了信噪比 并缩短了测量时间,使得其应用得到了迅速发展,己由化学领域发展到分子生物 学和临床医学研究领域,从离体分析发展到在体无损分析。傅立叶变换红外光谱 仪在生物样品研究中有很多优点:如待测样品可以固体、液体或气体,并且用量 少;不破坏样品结构,不但可以研究样品的表面结构,还可以研究样品的整体结 构;经过计算机数据处理后,水的吸收峰可以被扣除。经过傅立叶去卷积,重叠 的峰可以被分开,傅立叶去卷积技术是从重叠谱带中获取隐含信息(结构,含量) 的有效方法;能在分子水平上直接了解所研究分子或体系的结构等等。从1990年 口腔鳞状细胞癌【32】等细胞或组织的研究,并 肺癌【27】、皮肤癌㈣、乳腺癌陟311、 获得了一些有意义的结果:(1)肿瘤细胞和组织与正常细胞组织在吸收频率和相 对强度等谱学参数存在着明显的差异性,这些谱学差异性揭示它们在分子水平上 的组成和分子结构差异一。(2)红外光谱分析结果与病理诊断结果基本_致,并且 比病理诊断要更为准确,提示可以做为一种新型癌症早期检测方法。 §1.4同步辐射红外光源 中国科学技术大学硕士学位论文 1.4.1同步辐射及其特性 同步辐射是自由电子在磁场中作曲线运动时沿切线方向发射的电磁波,覆盖 了从红外到硬x射线的各种波长。运动着的电子具有加速度时,它会放出电磁辐 射,或者觉它会发光。因为光也是一种电磁辐射。当电子在磁场中作圆周运动时, 因为有向心加速度,所以也会发光。电子在同步加速器中绕着磁场作圆周运动时 发出的电磁辐射叫同步加速器辐射,简称同步辐射,或叫同步光。这种辐射首次 是1947年在美国通用电器公司的一台70MeV的电子同步加速器上发现的,因此 得同步辐射之名。由于同步辐射光具有光谱连续、亮度高、准直性好和有偏振、 脉冲时间结构等特点,与其他光源相比,具有无可比拟得优越性【拈】,因此在物理、 化学、生物。材料。信息以及环境科学等诸多领域中都有非常广泛得应用。 ①同步辐射的光谱连续性 同步辐射的光谱的形状是由加速器中的电子的能量和弯转半径决定的。同步 辐射光子的特征能量(特征能量是指光谱中光通量接近最大处的光子能量)与电 子能量的3次方成正比.或者说同步辐射的特征波长与发射它的电子的能量的3次 方成反比。电子的能量越高,同步辐射的特征波长越短。同步辐射的波谱不但连 续,而且覆盖范围宽广,覆盖了从红外线、可见光、紫外线、真空紫外线、x射线, 直到伽玛射线个数量级。同步辐射光谱的连续性,可以使研究人 员方便的取用所需要的波长的光束来进行科学研究。 ③同步辐射的高亮度 光源的亮度指每秒钟从单位光源面积,向单位立体角发射的波长范围在光子 波长的千分之一以内的光子数目。同步辐射光源的亮度比最强的X光管的特征线 的亮度大一于倍以上,比最强的x光管的连续谱的亮度大~百万倍以上。这种高 强度的光源使大大缩短了科学研究的时间,几分钟就可以完成本来需要几个星期 的实验。 ③同步辐射的光谱分布及亮度可准确计算性 根据电子储存环的物理参数,可以准确计算同步辐射的光谱分布及亮度,因 此它可以作为标准光源来校准光学仪器或标定其它光源。 ④同步辐射的高准宣性 因为同步辐射是电子在加速器中沿着环形轨道的切线方向,在一个很小的角 0 中国科学技术大学硕士学位论文 度范围内发射出来的。电子的能量越高,发射的角度越小。 ⑤同步辐射的偏振性 在电子轨道平面内发出的同步光是百分之百的线偏振的,而在轨道平面两侧 的同步光分别是左、右旋椭圆偏振光。利用不同偏振方向的同步辐射圆偏振光激 发,可以非常有效地研究一些具有结构不对称的生物大分子的结构或一些磁性材 料的磁性。而在x射线荧光分析中,则可利用同步光的偏振性抑制散射光的影响 而提高分析的灵敏度。 ⑥同步辐射脉冲时间结构 在储存环中作回旋运动的电子束是一团一团的,因此我们观察到的是有周期 性的脉冲光。束团的长度只有几个厘米,甚至只有几个毫米。利用同步辐射的脉 冲时间结构为动态过程的研究提供极好的条件。 ⑦同步辐射洁净性 同步辐射是高速电子在超高真空环境中产生的,因此它是一种十分洁净的光 源,和我们日常使用的普通光源有很大区别。只常使用的普通光源都不是非常“干 净”的光源,比如灯泡中灯丝会蒸发钨;气体放电灯需要稀薄的气体;而x光管中 电子轰击金属靶中的杂质或管内的残余气体时,也会产生这些杂质或残余气体的 特征谱线。因此,同步辐射光可以被用来做一些要求极高的研究,如进行材料的 表面研究或含量极低的元素分析。 1.4.2同步辐射红外光源的优势 用于傅立叶变换红外光谱的光源一般由高温黑体辐射产生的红外光,与黑体 辐射光源相比,同步辐射红外光源有很多优势: ①高亮度:红外同步辐射亮度是普通黑体辐射的1000倍,因此其所得的实验 数据信噪比也是普通黑体辐射的1000倍【”】。例如,对于一个1200K温度的黑体辐 射光源,即使采用最优良的室温(300K)探测器,其所能达到的信噪比也只有每 秒钟4:1,而采用红外同步辐射其所能达到的信噪比可提高1000倍即每秒钟4000 :1。合肥光源与2000K黑体辐射的相对亮度随波长的分布如下图所示: 中国科学技术大学硕士学位论文 图2NSRL的相对亮度(对2000K黑体辐射) ②宽范围:红外同步辐射波长覆盖从近红外到厘米波,并且强度随波长衰减 慢。在远红外区的红外同步辐射优势更为明显。 ③脉冲性:红外同步辐射具有脉冲结构,可以做时间分辨红外光谱。 ④偏振性:红外同步辐射在轨道平面是线偏振,远离轨道平面是椭偏的,并 且上下反对称。 §1.5本论文的选题依据及研究内容 通过前文的综述,我们知道傅立叶变换红外光谱(FFIR)已被广泛地用于宫颈 癌、结肠癌、肝癌,肺癌、皮肤癌、乳腺癌、 口腔鳞状细胞癌等细胞或组织的研 究,但是这些细胞或组织均要从病人体内获取,非常不方便,还给病人带来痛苦。 关于从人体外部器官的傅立叶变换红外光谱来检测癌症的报道较少,本文主要以 取样方便的指甲为研究对象,研究了不同癌症病人的指甲和正常人指甲在傅立叶 变换红外光谱上的区别,并特别研究了消化系统癌症一一食道癌、胃癌和直肠癌 病人与正常人指甲的FTIR区别,表明了一个系统内各器官的同源性和病变后的相 似表现。指甲是由是从表皮细胞演变出来的。表皮细胞从产生一直到死亡,不断地 新陈代谢,新的角蛋白不断产生出来。指甲的主要成分是角蛋白,一种不溶性纤 维状蛋白质,因此指甲粉术的红外光谱具有蛋白质特征峰。根据中医甲诊法理论pq 即爪甲是与肝、肺、心等其他脏器十二经脉起止交接的枢纽。指甲能在一定程度 上全息地反映人体脏腑、器官、组织各部分的病理生理变化。 为了与当前傅立叶变换红外光谱在癌症检测中应用衔接起来,本文也做了一 2 中国科学技术大学硕士学位论文 些癌症病人细胞和组织的FTIR研究,这样本文即从分子层面、细胞层面和组织层 面三个层面比较全面的研究了FITR用于癌症检测的可行性。 本文的另一个重要内容就是利用同步辐射光源作为傅立叶变换红外光谱仪的 新型光源,以期得到更好信噪比的FTIR图谱。 中国科学技术大学硕士学位论文 参考文献 【1]韩贻仁.分子细胞生物学(第二版)[M】.北京:科学出版社,2002. 【2】翟中和,王喜中,丁明孝,细胞生物学【M].北京:高等教育出版社2002 【3】霍红.1999.人体乳腺肿瘤的傅立叶变换红外光谱研究【D】:【硕士】.大连:中 科院大连化学物理研究所,4—8. 【4J刘庚年,谢敬霞,消化与影像诊断学,上海科技出版社,1992 [5】杨广夫,靳宝善,磁共振诊断学,西安,陕西科技出版社,1992 [6】李果珍,CT诊断学第二版,北京人民卫生出版社1994 【71马寄晓,刘秀杰,家用临床医学,原子能出版社,1991 【8】周永吕,郭万学,超声医学,北京科学技术文献出版社,1990 Tumor andclinical E(ed),Huma [9】Cimino Mark掣,Biology 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光谱范围:i/im一1000pm 接收角:75mrad.(H)60mrad.(v) CVD处光斑尺寸:5nml.2mm Pa 线 光束线。光学系统由前置镜箱、会刚石窗口CVD、和后置镜箱、 接口盘等组成。前置镜箱内有两块光学元件,m是水冷无氧铜平面镜,它吸收几 中国科学技术大学硕士擎位论文 乎所有短波长辐射,M2是一块超环面镜,材料为熔融石英镀金,它的作用是将同 步辐射以1:1的比例成像在cvD窗口上。后置镜箱内有两块光学元件,M3为超环 面镜,将以CVD窗口为光源点的同步辐射准直成平行光,M4为平面镜,起折转光 路的作用。接口盒内有两块光学元件,M5是一块平面镜,折转光路,M6是一块球 面镜,将同步辐射光聚焦到光谱仪的等效光源点,两块镜子都是15度入射,材料 为K9玻璃镀金。 图3红外光谱实验站光束线的示意图 光学元件的主要参数如下: 光学元件 曲率半径 材料 镀层材料 M。 平面 无氧铜 Au R=3686,r=1843 Au № 熔融石英 也 R=1236,r=1325K9玻璃 Au 地 平面 K9玻璃 Au 地 平面 K9玻璃 Au 魄 R=373 K9玻璃 Au §2.2实验方法 2.2.1样品准备 ①分子层面样品:指甲。基本可以分为三步。第一步,指甲粉末的获取。 用镊子取蘸有医用酒精的棉球擦拭指甲和指甲锉刀,去除指甲和锉刀表面的灰尘 和油脂。在一张干净的白纸上按牢要被锉指甲的手指,用锉734心的锉指甲表面 获取指甲粉末。如果一个指头所得的指甲粉术量不够,可以多取几个手指指甲粉 术混合到一起,这样不但增加了量,而且也具有均衡意义。第二步,研磨。取指 中国科学技术大学硕士学位论文 甲粉术与KBr粉术按大约1:100比例进行混合,放入研钵中研磨。研磨的时候, 开始力量要大,动作要慢,因为颗粒比较大,动作慢是防止混合物被研磨出研钵。 研磨到颗粒非常细,软的像面粉一样的时候即可。~般研磨时问在10~15分钟。 第三步,压片。将研磨好的指甲粉求和KBr粉末混合物小心的倒入压片模具中, 置入压片机中,压到大约5个大气压的时候停止压,保持这个压力大概5~lO 分钟,放气,解除压力并取出模具。小心的打开模具,倒置模具再放入压片机中 将压好的片子顶出来,用镊子取压好的样品片,立即放到样品架上进行红外光谱 检测或者用干净的纸包好放到干燥皿中保存。压片时间尽量缩短以降低KBr吸收 空气中水分对实验结果带来的影响。检测过的样品用干净的纸包好并编上号放到 干燥皿中保存。 ②细胞层面样品:宫颈脱落细胞和Hela细胞。宫颈脱落细胞是从妇科普 检中所得。用0.9%生理盐水收集拭子取得的富颈脱落细胞,每一样品分为两份 并编号以方便后期分析对比,一份作巴氏固定和染色,供细胞学检测使用;另一 份置入盛有生理盐水的离心管中。将离心管放入离心机中进行高速离心收集细 胞。离心速度为13000转/分,离心时间为3~5分钟。用移液器去除上清液,再 加入等量的生理盐水,进行离心,如此反复两到三次。用移滚器将沉淀的细胞轻 轻的吹散,混匀。然后吸取少量的细胞涂在硫化锌基片上成薄膜状,自然风干或 电吹风吹干,供FTIR检测。因为硫化锌基片要重复使用,所以每检测过一个样 品后要对硫化锌基片进行清洗。清洗用超声波法。先用棉球蘸取酒精或丙酮反复 的攘拭片子表面将细胞样品擦除。将擦拭过的硫化锌基片放入盛有酒精或丙酮的 培养皿中,置入超声波清洗机中进行清洗。一般清洗2~3次,每次10~20分钟, 酒精和丙酮可以交替使用。清洗好的硫化锌基片用蒸馏水冲干净.放入盛有蒸馏 水的培养皿中备用。 ③组织层面样品:胃癌样品。我们采用的是石蜡切片法。将用福尔马林固 定过的样品包埋于石蜡中,用超蒋切片机开始切。切的厚度大约为4微米。将切 好的石蜡片小心的平铺于热水中,用镊子捏住硫化锌基片小心的捞取石蜡片让其 平整的贴附在基片上。然后再将贴附有石蜡片的硫化锌基片放入110℃左右的烤 箱中烤,目的是将石蜡烤化去除,这样就留下胃癌样品贴附再基片上了-供FTIR 检测。同样,硫化锌基片是重复使用的,检测完样品后,即将对硫化锌基片进行 中国科学技术大学硕士学位论文 清洗。清洗方法和上述一样。此次因为客观条件影响,取的胃癌样品是用福尔马 林固定过的,一般是选取刚做完手术的新鲜样品。两者之间的差别和影响在后续 内容中将会有专门的讨论。 2.2.2仪器操作 首先打开傅立叶变换红外光谱仪和机械泵,设置好光源,即红外同步辐射 光源或普通黑体辐射红外光源。如果选用红外同步辐射光源,还需要打开后端的 机械泵。因为我们选用的是MCT探测器,所以要对其进行冷击口。将漏斗下端插入 探测器中,开始灌液氮直至在漏斗和探测器结合出有液氮溢出为止,这时说明探 测器已被灌满液氮并完全冷却下来。将上好样品的样品架放入光谱仪中,打开电 脑,运行操作软件。从软件界面打开气动阀,开始抽光谱仪内的线托的时候就可以测试样品,采集数据了。一个样品铡试好以后,关闭气 动阀,放气,打开样品室换下一个样品,重复前面的步骤。如果使用同步辐射光 源f1“,其步骤和普通黑体辐射红外光源‘3l的一样,就是多了后端的抽线分子层面样品一一指甲粉末 ¨肺癌患者和正常人指甲FTIR的特征 ①普通黑体辐射红外光源FTIR光谱 图4,图5分别是部分肺癌患者和正常人指甲粉末样品的胛IR光谱 中国科学技术大学硕士学位论文 似 ” 一.3 怕 ¨ 8辛而c∞lu一 们 ¨ ¨ 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Wavenumber(cm-1l 图4肺癌患者指甲粉末样品FTIR光谱 他 ¨ 一.己e)^1acmlu— 盯 ¨ :宝 ¨ 4000 3500 3000 2500 2000 500 1000 wavenumber(cm-1) 图5正常人指甲粉木FTIR光谱 我们选取了差别最明显的一条肺癌患者指甲粉术样品FTZR光谱,对其和J下 中国科学技术大学硕士学位论文 常人指甲样品PTIR光谱进行对比和分析。我们将肺癌患者指甲粉末样品FTIR光谱 和正常人的放到一个坐标系中,分别标出各自吸收峰的波数值,对两者进行详细 的分析如下; 实验得到的光谱图在4000-400c酊1的中红外区,吸收峰主要集中在 以便观察起来直观。 a b 翻 锄3蜘固0D3ffD固∞翻∞翻∞ 图6在3500—2500CIn。1之间的肺癌患者和正常人指甲的FTIR光谱 a——J下常人; b——月巾癌患者。 中国科学技术大学硕士学位论文 彻0铂。0 1鲫14。01卸 1000 800 图7在2000-800cml之间的肺癌患和正常人指甲的FTIR光谱 a——J下常人; b——肺癌患者。 i谱带指认 H伸缩振动:2848cm-’和 3315cml和3061cml分别属于蛋白质酰胺A带和B带N 和II带;1454 P吼’的对称和反对称伸缩振动;1041cm“属于糖原C一0的伸缩和弯曲振动。各谱线 的初步指认和比较见表1 中国科学技术大学硕士学位沦文 表1肺癌患者和正常人指甲的红外光谱吸收峰振动模式的初步指认与频移比较 jF常人指甲 帅癌患者指甲 粉术吸收峰 粉术吸收峰位 频移 振动模式 位置 置 (cml) (Cm。。) (cml) 3315 3306 蛋白质酰胺A带N—H伸缩振动 9 3061 3068 蛋白质酰胺B带N—H伸缩振动 7 2848.2918 2848,2920C№的对称伸缩和反对称伸缩扳动 0,2 2872,29562872,2958cH,的对称伸缩和反对称伸缩振动 0,2 1651 1651 蛋白质酰胺I带 0 1539 1637 蛋白质酰胺II带 2 1454 1454 cH:弯曲振动 0 1396 1392 CH。弯曲振动 4 1172 1172 蛋白质分子C—O伸缩振动 0 1072,12321078.1236核酸分子磷酸二脂基团PO。一的对称和 6,4 反对称伸缩振动 1041 1047 糖原c一0的伸缩和弯曲振动 6 ii谱带分析 通过上述的比较发现肺癌患者和正常人指甲红外光谱在很多吸收峰处都有 所不同,而且和相关报道‘4。7]相比有新的条带发现。下面我们对其差别分别进行 分析和讨论: 肺癌样品在3315cml处蛋白质酰胺A带N~H峰相对于正常人样品向低频移了 约9ca~,这点和关于肺癌组织样品的报道[51中一致,而在3061cln1处蛋白质酰胺B 带N—l{峰却又向高频移T7cm-1,这是在肺癌组织样品中没有发现的一条带。这可 能与氢键化形式和程度不同有关。 2848cm-I 2956cml归属于指甲中角蛋白脂质cH基团的伸缩振动峰,其中 于CH,的对称伸缩和反对称伸缩振动;与正常人指甲样品相比,肺癌患者指甲样 品在CH。和CH{的对称伸缩处没有发生频移,而在CH!和CH:,的反对称伸缩处向高各 频移了2cm_1,而且吸收峰的强度变弱,峰形也变得较平缓。通过对CH!和CH。的 相对吸收强度比值A。。/A。:和如。。/如。分析表明,肺癌指甲样品在这两处的比 值比『F常人样品的要小,这和关于肺癌组织样品的报道截然相反。可能由于样品 中国科学技术大学硕士学位论文 成分不同导致。因为指甲中以蛋自质为主,脂质很少,而组织中脂质含量比较大。 也就是’烧,在指甲样品中,cH基团的伸缩振动和反对称伸缩振动主要是由角蛋白 贡献的,脂质的贡献很少。 肺癌患者指甲在1651cm“蛋白质酰胺I带处与正常人指甲相比没有发生频 移,但在1539cml蛋白质酰胺IJ带处,向低频移了2cm~,可能由于癌变后蛋白质 中一些C-N键发生断裂。 1454cml属于角蛋白脂质cH湾曲振动。肺癌患者指甲和正常人指甲在这个波 数处却没有明显区别。1396cm‘属于角蛋白脂质cH,弯曲振动,在此处,肺癌指甲 和』下常人指甲红外光谱区别很明显,向低频移T4cm’,这点和其它癌症指甲样品 1又不相同。可能由于各种癌症本身和样品的取样不同有关。 在核酸分子磷酸二酯基团P仉’的对称和反对称伸缩振动的两个吸收峰处,肺 癌患者指甲和正常人指甲的差别也非常明显。正常人指甲分另1j位于1072cffl和 1232cml,而肺癌患者指甲分别向高频移了6c盯‘和4cm~,并且在这两处的相对吸 收强度比正常人指甲的要大,在1072cm‘处尤为明显。由此表明,肺癌患者指甲 中的核酸含量大大增加了【”。可见,人体内部脏器的病变可以导致指甲中核酸分 子内磷酸二酯键骨架结构的变化。这点是和肺癌组织以及其它癌症指甲样品相一 致的地方。癌变最基本的机理还是核酸的变化,核酸是癌变时相对其它生物大分 子最敏感,最容易发生改变,因此这个峰可以作为癌症检测的特征峰。 1041cml属于糖原c-O的伸缩和弯曲振动。肺癌指甲在此处相对于正常人指甲向高 频移Y6cm~。这条谱带也是在肺癌组织以及其它癌症指甲样品没有发现的一袈 蝰。 iii结论 通过上述分析可以看出,肺癌患者指甲和J下常人指甲的红外光谱有很大差 异性,反映了癌变前后人体内的一些主要火分子的结构变化,主要差异表现在: (1)蛋白质酰胺带由于氡键化形式和程度不同导致的波数频移:肺癌患者指 质酰胺B带N—H峰向高波数频移; 弯曲振动向低波数频移; 中国科学技术大学硕士学位论文 (3)CH:和c扎胸相对吸收强度比值k.√^,:和A。/A。在肺癌患者指甲中 要小于正常人指甲; (4)肺癌患者指甲在i072cm“处核酸分子磷酸二酯基团P吼’的对称伸缩振动的 相对吸收强度明显高于正常人指甲。 (5)肺癌患者指甲在1041cm。处糖原C—O的伸缩和弯曲振动向高波数频移。 ②同步辐射(sR)光源FTIR光谱,如图8,图9所示 065 0.60 0.55 —0,50 i0.45 9.40 v 台0.35 20.30 ∞ 苫0,25 0.20 0.15 010 。如一j五——蕊——品——品r1—五—i五i— Wavenumber(cm-1) 图8肺癌患者指甲粉末SR—FrlR光谱 中国科学技术大学硕士学位论文 wavenumber(cm一1) 图9正常人指甲粉末SR_FTIR光谱 ㈢消化道癌患者和正常人指甲FTIR的特征 ①普通黑体辐射红外光源FTIR光谱,如图lO,ll,12所示: 盯 ¨ ¨ ¨ ¨ 一习8蚤丽c∞lu— ¨ 4000 Wavenumber(cm4) 图10食道癌患者指甲粉术FT[R光谱 中国科学技术夫学硕士学位论文 0:4 ’ 3 空03 而 三 02 2500 2000 1500 1000 Wavenumber{cm。) 图lI胃癌患者指甲粉末FTIR光谱 1·3 1.2 1·1 o ]1O 8 奎0.9 重n8 三 07 n6 n5 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1D00 Wavenumber(cm。1) 图12直肠癌患者指甲粉未FTIR光谱 中国科学技术大学硕士学位论文 下面对消化道癌患者和J下常人指甲样品FTIR光谱进行对比和分析: 实验得到的光谱图在400.4000cm。的中红外区,吸收峰主要集中在 常人指甲粉来在2500.3500cm。和800,2000cm。区域内的红外光谱图。 己 墨 E ‘重 兰 N R S 28130 3000 3200 WavenutrOer/oriI 图13消化道癌患者和正常人指甲粉末在2500--3500cm…范围内的红外光谱 E一食道癌 N一正常人 R一直肠癌 s一胃癌 中国科学技术大学硕士学位论文 他 E ¨ N 加 S ] ∞ 仍 )、 !∞ ∞ R C n) 亡 叮 ∞ ∞ ¨ ∞ 800 1000 12口0 1400 1600 1800 2000 图14消化道癌患者和正常人指甲粉末在800cm~2000cm1范围内的红外光谱 E一食道癌 N一正常人 R一直肠癌 S一胃癌 i谱带指认 胺I带和II带;1454 酸二脂基团P0。一的对称和反对称伸缩振动;1041cm。1属于糖原C.O的伸缩和弯曲振 动。各谱线的吸收峰位置和振动模式初步指认见表2。 中国科学技术大学硕士学位论文 蔗- o ∞∞ 盅i 詈;晶器 客望gi;§篙窖溶壹;§::li 吼霎萋萋 籍 器苗 黼”’ H 咕co o ∞ ∞ q q ^ H P H ¨ P ^ p 吣 ∞u∞ 。

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